Caracterización de proteínas

RESUMEN

La practica de caracterizacion de proteinas consistio en el reconocimiento de proteinas de diferentes muestras mediante el proceso de biuret y xantoproteica. Las distintas muestras utilizadas son la caseina de leche, gelatina, ovoalbumina, aspartamo y glicina.

Objetivos

Reconocer la presencia de proteínas en alimentos como leche, gelatina, huevo, aspartamo y glicina.

Materiales:                              Reactivos utilizados:
Vaso de Bohemia                       Leche en polvo
Tela metálica                            Gelatina
Mechero                                   Clara de huevo
Soporte                                    Edulcorante "Aspartil" 
Varilla de vidrio                         Agua

Gradilla                                    NaOH 
Tubo de ensayo                         CuSO4 
Termómetro                              Ácido nítrico concentrado
Papel de filtro                           Ácido acético

FUNDAMENTOS

Se utilizaron dos ensayos, el ensayo de biuret y reaccion xantoproteica.

Acerca del ensayo de biuret:

El reactivo de Biuret contiene CuSO₄ en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH).  La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu²⁺ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma  parte de los enlaces peptídicos, esto si la reacción da positiva. Cuando la reacción de biuret da negativa, queda de color azul.

 (Resultado de la reacción de biuret)

                                              (Izq.: resultado negativo der.: positivo)

Procedimiento de la reacción de Biuret:

La reacción  de Biuret es un ensayo general para las proteínas. Cuando una proteína reacciona con el CuSO4 (azul), la prueba positiva es la formación de un complejo de color violeta.

Reacción xantoprotéica:

Esta reacción se debe a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. Generalmente, se forma primero un precipitado blanco que cambia a amarillo al calentarlo. El color se empieza a tornarse anaranjado cuando la solución se vuelve básica. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos, tirosina, fenilalanina y triptofano, obteniéndose nitrocompuestos de color amarillo, que se  vuelven anaranjados en medio fuertemente alcalino (formación del ácido pirámico o trinitrofenol). En esta prueba se produce la nitración del anillo bencénico presente en dichos aminoácidos. Las manchas amarillas en la piel se causan por el ácido nítrico son el resultado de una reacción xantoprotéica. 

MUESTRAS UTILIZADAS: 

CASEÍNA: 

Es una proteína de carácter acido debido a su elevada proporción de aminoácidos ácidos (PI=4,6). La caseína humana es más rica en cistina y en glúcidos que la de vaca lo que la hace más apropiada para el bebe. Reacciona con las bases formando caseinatos utilizados en la industria para la fabricación de colas y adhesivos. También se utilizan en la industria textil. La caseína recipita por acción de los ácidos. Esto puede ocurrir a través de la formación de acido láctico por la acción bacteriana sobre la lactosa o mediante el agregado de un acido hasta alcanzar el pH correspondiente a su punto isoeléctrico. La precipitación puede producirse por la acción enzimática de la quimiotripsina.

Estructura  primaria de la caseína: 

GELATINA: 

La gelatina es una mezcla coloide (sustancia semisólida), incolora, translúcida, quebradiza e insípida, que se obtiene a partir del colágeno procedente del tejido conectivo de despojos animales hervidos con agua.

La gelatina es una proteína compleja, es decir, un polímero compuesto por aminoácidos. Como sucede con los polisacáridos, el grado de polimerización, la naturaleza de los monómeros y la secuencia en la cadena proteica determinan sus propiedades generales. Una notable propiedad de las disoluciones de esta molécula es su comportamiento frente a temperaturas diferentes: son líquidas en agua caliente y se solidifican en agua fría. Está compuesta de la siguiente manera: 84-90% proteína proveniente del colágeno,1-2% sales minerales, el porcentaje restante es agua.

Colágeno

OVOALBÚMINA:

La ovoalbúmina es la principal proteína de la clara del huevo (60-65% del peso de la clara de huevo). Pertenece a la superfamilia proteínica de las serpinas, aunque a diferencia de la mayoría de éstas la ovoalbúmina no es capaz de inhibir cualquier peptidasa. Algunos autores señalan la capacidad que posee la ovoalbúmina de anular las enzimas digestivas y por esta razón señalan que es un mecanismo protector contra las bacterias exteriores agresoras al huevo. Esta proteína se desnaturaliza fácilmente al agitar la clara. Además es la proteína de mayor valor biológico, ya que tiene muchos de los nueve aminoácidos esenciales. 

ASPARTAMO: 

El aspartamo es un edulcorante no calórico,es estable cuando se encuentra seco o congelado, pero se descompone y pierde su poder edulcorante con el transcurso del tiempo, cuando se conserva en líquidos a temperaturas superiores a 30 °C.La dulzura relativa del aspartamo es de 150 a 200 veces más dulce que el azúcar. Es necesario destacar que todos los edulcorantes se clasifican con respecto a la sacarosa o azúcar común, por lo que el valor de 200 veces es obtenido en comparación con diluciones hechas en laboratorio de sacarosa .

GLICINA:

La glicina es uno de los aminoácidos que forman las proteínas de los seres vivos. Es el aminoácido más pequeño y el único no quiral de los 20 aminoácidos presentes en la célula. Su fórmula química es NH₂CH₂COOH. La glicina es un aminoácido no esencial.

RESULTADOS: 

           Muestra                        Biuret                     Xantoprotéica

• Caseína de                        +                                +
  la leche
• Gelatina                           +                                -
                                                  
• Ovoalbúmina                    +                                 -
    
• Aspartamo                        -                                  -
• Glicina                             -                                   -

INTERPRETACIÓN Y EXPLICACIÓN DE LOS RESULTADOS: 

Caseína de la leche:

En el caso de la caseína colocamos aprox. 25 mL de leche en polvo en un vaso de bohemia. Calentamos hasta aprox. 40º C agitando con varilla de vidrio. Agregamos acido acético 2,0 M (gota a  gota) agitando en forma continua hasta coagulación total. Separamos el coágulo de caseína del suero.  Luego secamos la caseína con el papel de filtro. Separamos dos porciones del solido obtenido de un tamaño pequeño acorde al diámetro de los tubos de ensayo y las colocamos en dos de ellos.

Reacción de Biuret: Agregamos sobre la caseína de uno de los tubos 20 gotas de CuSO4. Luego agregamos 6 gotas de solución de NaOH. 

Reacción Xantoprotéica: Agregamos sobre la caseína del segundo tubo 10 gotas de HNO3.

 

A la izquiera está el resultado de la reacción de Biuret. Como resultó de color violeta podemos afirmar la presencia de al menos dos enlaces peptídicos en la caseína de la leche.

A la derecha está el resultado de la reacción Xantoprotéica. Como nos quedó de color amarillo, podemos deducir que la caseína de la leche presenta alguno de los siguientes: grupos bencénicos, tirosina, fenilalanina o triptofano.

Gelatina: 

Colocamos un sobre de gelatina en polvo incolora en un vaso de bohemia. Luego agregamos agua  y calentamos hasta ebullición, agitando constantemente con una varilla de vidrio. Vertimos una muestra del contenido en dos tubos de ensayo. 

Reacción de biuret:  Agregamos sobre la gelatina de uno de los tubos 20 gotas de CuSO4. Luego agregamos 6 gotas de solución de NaOH. 

Reacción Xantoprotéica: Agregamos sobre la gelatina del segundo tubo 10 gotas de HNO3.

Izq.: xantoprotéica Der.: Biuret

La muestra del ensayo xantoprotéica resultó incolora , por lo tanto no hay presencia de grupos bencénicos, tirosina, fenilalanina y triptofano. 

La muestra del ensayo de biuret resutló violeta, por lo tanto podemos afirmar que la cadena protéica de la caseína presenta al menos dos enlaces peptídicos.

Ovoalbúmina: 

Separamos la yema de un huevo y colocamos cantidades suficientes en dos tubos de ensayo. 

Reacción de biuret:  Agregamos sobre la yema de huevo de uno de los tubos 20 gotas de CuSO4. Luego agregamos 6 gotas de solución de NaOH. 

Reacción Xantoprotéica: Agregamos sobre la yema de huevo del segundo tubo 10 gotas de HNO3. 

A la izquiera está el resultado de la reacción de Biuret. Como resultó de color violeta podemos afirmar la presencia de al menos dos enlaces peptídicos en la ovoalbúmina.

A la derecha está el resultado de la reacción Xantoprotéica. Como nos quedó de color amarillo, podemos deducir que la ovoalbúmina presenta alguno de los siguientes: grupos bencénicos, tirosina, fenilalanina y triptofano.

Aspartamo: 

Tomamos dos muestras de "Aspartil" y las colocamos en dos tubos de ensayo.

Reacción de biuret:  Agregamos sobre la muestra de "Aspartil"  de uno de los tubos 20 gotas de CuSO4. Luego agregamos 6 gotas de solución de NaOH. 

Reacción Xantoprotéica: Agregamos sobre la muestra de "Aspartil" del segundo tubo 10 gotas de HNO3. 

A la izquierda podemos observar el ensayo de la reacción xantoprotéica el cual nos dio negativo. Esto quiere decir que el aspartamo no presenta grupos bencénicos, tirosina, fenilalanina o triptofano.

A la derecha observamos el ensayo de la reacción de biuret, el cual nos dió negativo, ya que es azulado. Esto nos indica que el aspartamo no presenta dos o más enlaces peptídicos.

Glicina: 

Colocamos dos muestras de glicina en dos tubos de ensayo.

Reacción de biuret:  Agregamos sobre la glicina de uno de los tubos 20 gotas de CuSO4. Luego agregamos 6 gotas de solución de NaOH. 

Reacción Xantoprotéica: Agregamos sobre glicina del segundo tubo 10 gotas de HNO3. 

A la derecha está el ensayo de biuret, el cual resultó ser negativo debido al colo azul. Esto nos permite afirmar que la glicina no presenta ni dos o más enlaces peptídicos en su cadena.

A la izquierda está el ensayo de xantoprotéica, el cuál nos dió negativo también, ya que está incoloro. Este resultado nos indica la ausencia de 

grupos bencénicos, tirosina, fenilalanina y triptofano.